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                潜在抗癌药物有机硒(NSAIDs-SeCN和SeCF3)衍生物的合成及生物学评价

                发表于:2020-09-29   作者:贺贤然等   来源:European Journal of Medicinal   点击量:



                摘要
                一系列基于非甾体抗炎药(NSAIDs)支架和硒功能体(-SeCN和-SeCF3)的有机硒化合物被合成及表征,并对四种癌细胞系SW480(人结肠癌细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞)、A549(人肺腺癌细胞),MCF-7(人乳腺腺癌细胞)进行了评估。有趣的是,大多数被研究的化合物在降低不同癌症细胞系的活性方面表现出活性。活性最强的化合物3h对4种肿瘤细胞株的ic50值均小于20微摩尔,尤其对SW480和MCF-7的ic50值分别为4.9和3.4微摩尔。此外,选择NSAIDs-SeCN衍生物(2h和2i)和NSAIDs-SeCF3衍生物(3h和3i),通过调节抗凋亡Bcl-2蛋白、促炎细胞因子(IL-2)和促凋亡caspase-3蛋白的表达,研究其诱导MCF-7细胞凋亡的能力。此外,通过2,2 -二苯基-1-苦基肼(DPPH)、博莱霉素依赖性DNA损伤和类似谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的检测对合成的候选有机硒的氧化还原性能进行了研究。总之,这些NSAIDs-Se候选药物可能为进一步潜在的抗癌药物开发提供有前景的新的先导衍生物。
                 
                1.简介
                非甾体抗炎药(NSAIDs)是一类广泛应用于临床治疗包括关节炎疼痛在内的多种炎症性疾病的药物。另一方面,越来越多的研究探讨了非甾体抗炎药的化学预防作用,如阿司匹林(ASA)和其他非甾体抗炎药可作为化学预防剂,特别是在结直肠癌(CRC)中。其他研究表明,每天服用ASA可以降低多种癌症的风险,包括肺癌、乳腺癌、皮肤癌、胰腺癌和卵巢癌。此外,越来越多的研究致力于非甾体抗肿瘤活性,尽管其确切的分子机制仍不清楚。
                硒是一种独特的微量元素,对人类健康和疾病起着至关重要的作用。报道了具有不同官能团的有机硒化合物,包含硒酯、硒氰酸酯、硒酸甲酯、异硒氰酸酯、二烯醚和内环硒等及它们的抗癌活性(图1)。在这些化合物中,有机硒氰酸盐在过去二十年中已成为一种很有前途的候选化合物。第一个描述的硒酸盐是1,4-苯基双(亚甲基)硒代酸盐(p-XSC),它被证明对前列腺癌和口腔癌有效细胞。最近, 具有生物活性的有机三氟甲基硫醚(-SCF3)由于其独特的性质,如高亲脂性(Hansch常数p¼1.44)、代谢稳定性和电子吸收效应,受到越来越多的关注。与三氟甲基硫化物组相比,三氟甲基硒化物(-SeCF3)组被认为具有更好的亲脂性和稳定性。然而,目前有关SeCF3分子生物学性质的文献报道甚少:近年来,人们特别关注三氟甲基硒化分子的合成方法。

                在本报道中,考虑到非甾体抗炎药的化学预防作用和有机硒化合物的抗癌活性,结合支持硒功能修饰非甾体抗炎药支架的报道,设计了几种非甾体抗炎药SeCN和非甾体抗炎药SeCF3衍生物,其分子中包含三个基本片段:i)NSAIDs片段;ii)供电子基团;iii)含硒原子的官能团(图2)。用人癌细胞系SW480(人结肠癌细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)评价化合物的抗癌活性。此外,通过DPPH、博莱霉素非依赖性DNA损伤和GPx样分析,研究了化合物的抗氧化能力。最后,将对接研究作为一个初步的预测工具来评估所制备的NSAIDs-Se化合物的可药性。

                2. 结果与讨论
                2.1 化学
                在这里,我们提出了新家族的非甾体抗炎药硒代物作为潜在的抗癌剂:硒代氰酸盐,三氟甲基硒化物。
                以市售的非甾体抗炎药和3-硒代溴代丙烷(1)为原料,以EDCI和HOBT为缩合剂,DMF为溶剂,在氮气气氛下合成了非甾体抗炎药SeCN衍生物(2a-2j)(方案1)。
                在氮气气氛下,以KSeCN为亲核供体,在乙腈溶剂中,用-SeCN取代3-溴丙酰胺氢溴酸盐中的-Br原子,得到化合物1(方案1)。
                在四丁基氟化铵(TBAF)存在下,用三甲基(三氟甲基)硅烷(TMSCF3)与相应的硒代氰酸酯衍生物进行反应,得到了三氟甲基硒化物,得到了高收率的3a-3j(收率≥ 85%)(方案1)。

                2.2细胞活力测定
                方案1中报告的所有受试非甾体抗炎药Se衍生物均评估其对来自不同人类癌症类型的人类肿瘤细胞系的抗癌活性:SW480(人结肠癌细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)。体外抗癌活性的评价采用MTT法,在3个时间点(24h、48h和72h)进行,采用先前发表的NSAIDs-Se杂化化合物(硒代考昔布-1及其谷胱甘肽结合物)的方法,几乎没有变化。
                如表1所示,所选的非甾体抗炎药专利(舒林酸、吲哚美辛和酮基布洛芬)即使在最大剂量为50μM的情况下也不会对癌细胞的生存能力产生影响。杂交硒衍生物2a2d3e的IC50值表明,在相应的母体非甾体抗炎药中引入SeCN或SeCF3部分,对肿瘤细胞株有显著影响。根据这一观察结果,本研究报告了含硒氰酸盐和三氟甲基硒化物支架的非甾体抗炎药硒衍生物的合成及其对表2中使用的相同细胞系的体外抗癌活性。

                对表2的汇总和IC50值进行概述分析,结果表明,所有化合物对所有四种癌细胞系均有中等程度的作用,而化合物2a2e2h2i3a3b3d3e3g3h3i在所有时间点均有效。化合物2h2i3h3i对SW480细胞具有细胞毒性,其IC50值低于10μM。化合物3h3i对MCF-7细胞具有细胞毒性,IC50值小于5μM。从目前的细胞毒活性实验来看,所有化合物对特定的肿瘤细胞株似乎都没有选择性,有待于进一步扩大肿瘤细胞系的研究范围,寻找这些化合物的选择性细胞毒性。
                有趣的是,NSAIDs-SeCF3衍生物(3a-3j)的抗癌活性优于相应的NSAIDs-SeCN衍生物(2a-2j),可能是由于亲油性的增加,增强了这些NSAIDs-SeCF3衍生物的抗癌活性。在所测化合物中,化合物3h3i比其它衍生物具有更高的活性。化合物3h对4种肿瘤细胞株均表现出最强的抗肿瘤活性,IC50值在20μM以下,对MCF-7(72h时为2.8μM)和SW480(48h时为3.3μM)具有显著的抗癌活性。

                2.3 MCF-7细胞中Bcl-2、IL-2和caspase-3分子生物标志物的评价。
                先前的研究表明,有机硒化合物的潜在死亡机制可能是诱导细胞凋亡。通过检测各种细胞变化(如细胞形态、细胞周期延迟、caspase 3/7和caspase 8的激活)证实了这一点。
                为了探索合成化合物降低细胞活力的机制,我们选择了最有前途的NSAIDs-Se衍生物2h、2i、3h和3i,通过调节抗凋亡Bcl-2蛋白的表达,研究了它们诱导MCF-7细胞凋亡的能力,促炎细胞因子(IL-2)和促凋亡caspase-3蛋白。
                如图3所示,与未处理的细胞相比,所有化合物均能下调MCF-7细胞中Bcl-2的表达,上调IL-2和Caspase-3的表达。有趣的是,与未处理细胞相比,化合物3h和3i下调了超过50%的Bcl-2表达水平。此外,化合物2h可调节IL-2水平,与未经处理的对照细胞相比,表达量最多增加1.5倍。最后,化合物3i表现出更强的活性,使caspase-3的表达水平比未经处理的细胞提高了5倍。从以上结果来看,化合物2h、2i、3h和3i可能诱导肿瘤细胞凋亡以抑制肿瘤细胞的生长,并符合一些有机硒化合物的潜在机制,这些化合物通过潜在的生物标记物被报道对前列腺癌和口腔癌细胞有效。

                2.4抗氧化试验
                活性氧(ROS)是一系列活性氧团簇,存在于所有有氧细胞中。ROS被认为是调节多种生理功能的信号分子过程。各种各样人类疾病,包括不同类型的癌症,都与细胞内氧化还原平衡和氧化应激(OS)有关。氧化还原调节剂在潜在的抗肿瘤化疗药物中起着重要作用。
                   由于在过去几年中合成了许多有机硒化合物以用作氧化还原调节剂,因此采用不同的生化分析方法,如DPPH、博莱霉素依赖性DNA损伤和Gpx样分析,进一步评估了所选合成化合物的抗氧化活性。
                2.4.1自由基清除能力(DPPH)测定
                目前已发展了多种方法来快速预测天然化合物的抗氧化能力,但DPPH化学分析被认为是评价营养产品和有机硒化合物自由基清除活性的快速工具。化合物的抗氧化活性是通过它对DPPH脱色的能力来评估的。自由基(在甲醇中呈紫色)转化为DPPHH(无色),并通过517 nm处的吸光度下降来估计自由基的清除活性。采用维生素C作为阳性对照(表3)。

                如表3所示,非甾体抗炎药SeCF3衍生物3h和3i是本试验中活性最高的化合物,与维生素C相比,具有良好的自由基清除活性。除2d和3d的比较外,NSAIDs-SeCF3衍生物家族在本试验中优于相应的NSAIDs-SeCN衍生物。
                2.4.2博莱霉素DNA损伤试验
                博来霉素(BLM)是一类来自轮状链霉菌的抗肿瘤药物,被认为能氧化DNA,诱导单链和双链断裂。博来霉素铁DNA损伤试验已作为检测药物和有机硒化合物潜力的初步方法。如表3所示,化合物2d、3b、3g和3i对DNA降解的诱导作用明显大于其它受试化合物。
                2.4.3谷胱甘肽过氧化物样活性测定
                谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是一种重要的硒化酶,在人体内被发现,它以内源性巯基谷胱甘肽(GSH)为代价来减少毒性过氧化物。用NADPH还原酶偶联法测定了所有NSAIDs -Se衍生物的潜在抗氧化活性。合成化合物的GPx活性由NADPH氧化为NADP+引起的吸光度下降(340nm)来估算。以依布硒啉为阳性对照。
                如图4所示,化合物2h、2i、3b、3e、3h和3i表现出比其他衍生物更好的GPx样活性。化合物3h是本实验中活性最高的衍生物,是GPx模拟依布硒啉的3倍。

                2.5对接研究
                基于先前揭示的ethaselen结合模式,研究了对另一种含硒酶硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1) 分别以Cys497和Sec498为硒烯基共价键的复合药性。这里我们采用了非共价对接的方法,因为共价配体的结合方式大多由非共价相互作用决定。
                采用柔性对接法将具有良好抗氧化活性的化合物2h,3h,3i连接到大鼠Sec498Cys突变体TrxR1蛋白(PDB id:1H6V)中。硒原子与Cys497或Cys498(0.5nm截止)之间的距离,根据二硫键的接近性规则,评估半胱氨酸硫醇攻击硒化物的可及性。对于每一个被测化合物,产生了多种结合位姿,其中最好的结合位姿是在平衡考虑结合能和与Cys497/Cys498的空间接近性的情况下选出的。
                如表4所示,对所有潜在姿势的总体分析给出了结合亲和力和共价反应可能性的评估,表明化合物3h是最有可能的TrxR1抑制剂,平均eCDocker能量最高,硒-半胱氨酸相互作用的可能性更大。与3h相比,化合物2h除了具有相同的骨架外,还具有一个氰基,通过氢键直接定向活性硒原子,在大多数情况下,远离Cys497/Cys498,这说明了平均Se-S Cys498增加的原因距离。对接化合物3i的性能不太令人满意,可能是由于非甾体抗炎药核与结合腔的相容性较差。尽管如此,3i在某种程度上是干扰Cys497的最有能力的一个。

                对于图5中的每个顶位,硒原子在羰基氧和邻近的氢键的帮助下,都能容易地接触到活性Cys497/Cys498残基(如Ser404),以及苯环和芳香族残基的p - p堆积(如Trp 407)。

                3.结论
                综上所述,本研究报道了新的有机硒衍生物的合成,包括非甾体抗炎药支架和硒功能(-SeCN和-SeCF3),化合物3h对MCF-7(72h时为2.8μM)和SW480(48h时为3.3μM)具有显著的抗癌活性。选择化合物2h2i3h3i,验证有机硒化物是否通过调节Bcl-2、IL-2和caspase-3分子标记物的表达,诱导MCF-7细胞凋亡,与未经处理的MCF-7细胞相比,所选化合物能够下调Bcl-2的表达,上调IL-2和Caspase-3的表达。此外,一些合成的NSAIDs-Se杂化化合物(如2d2h2i3b3d3e3g3h3i)在抗氧化性评价中表现出抗氧化活性,包括DPPH、博莱霉素依赖性DNA损伤和Gpx样检测。总的来说,考虑到这些非甾体抗炎药硒衍生物对癌细胞活力、抗氧化活性和对接研究的效力,在一些非甾体抗炎药中引入硒化物(-SeCN)或三氟甲基硒化物(-SeCF3)部分可以作为进一步设计这种非甾体抗炎药Se抗癌剂的一个很有前景的出发点。
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