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                萝卜硫素干预自闭症谱系障碍(ASD)

                发表于:2021-05-13   作者:Singh K   来源:Proceedings of the National Ac   点击量:

                原文: Singh K ,  Connors S L ,  Macklin E A , et al. Sulforaphane treatment of autism spectrum disorder (ASD).[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(43):15550.
                翻译:
                萝卜硫素干预自闭症谱系障碍(ASD)
                Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Oct 28;111(43):15550-5.
                doi: 10.1073/pnas.1416940111.
                摘要:自闭症谱系障碍(ASD)的特征是沟通、社交障碍以及刻板的行为,平均每68名儿童中就有1人发病,主要是男性。ASD的医疗经济负担巨大,并且没有公认的针对ASD核心症状的治疗措施。在一项安慰剂对照、双盲、随机试验中,患有中度至重度ASD的年轻男性(年龄13-27岁)分别接受了植物化学物质萝卜硫素(n = 29)——来自西兰花芽苗提取物——或难以区分的安慰剂(n = 15)干预。每日口服50-150μmol萝卜硫素,连续服用18周,随后的4周停止干预,父母/护理人员和医生利用三个被广泛接受的行为量表对干预效果进行评价:异常行为检查表(ABC)、社交反应量表(SRS)和临床总体印象改善量表(CGI-I)。ABC和SRS的初始得分与安慰剂和萝卜硫素组受试者非常匹配。在18周后,安慰剂组受试者发生微小的变化(< 3.3%),而萝卜硫素干预组的评分发生明显下降(行为改善):34%的ABC(与干预组相比P < 0.001)和17%的SRS评分(P = 0.017)。在CGI-I 评价方面,萝卜硫素干预组在社交互动、异常行为和语言交流方面有明显改善(P = 0.015-0.007)。停用萝卜硫素后,所有量表的总分均回到干预前水平。选择具有公认低毒性的膳食萝卜硫素能够逆转与ASD相关的异常,包括氧化应激和较低的抗氧化能力,谷胱甘肽合成降低、线粒体功能和氧化磷酸化降低、脂质过氧化增加和神经炎症。
                 
                自闭症谱系障碍(ASD)是一种常见的神经发育异常,以社会交往障碍、言语交流困难、兴趣狭窄和重复刻板的行为动作为主要特征(1)。ASD在美国8岁儿童中的患病率约为1 / 68,以男孩发病居多(4.5:1) (2)。没有针对ASD核心症状的有效药物治疗方法。我们在此报告,在一项安慰剂对照、双盲、随机临床试验中,每天使用萝卜硫素干预4-18周,可以显著改善大多数被诊断为中度至重度自闭症的年轻男性的异常行为和社交障碍,并且这种改善在停止治疗后会出现倒退。医生和家长/护理人员通过行为结果评估临床改善情况。
                萝卜硫素是来自西兰花的异硫氰酸酯。其治疗潜力基于其在转录水平上调细胞保护基因的表达,这些基因保护有氧细胞免受氧化应激、炎症、DNA损伤亲电试剂和辐射损伤(3,4)。在基础条件下,这些保护系统不能发挥最大的保护作用,但可以通过萝卜硫素诱导到更高的活性水平,从而降低患恶性肿瘤和其他慢性疾病的风险(5-10)。目前,针对萝卜硫素正在进行广泛的临床评估(10)。
                评估萝卜硫素对ASD的治疗效果基于四个前提。首先,大量证据表明,萝卜硫素可以纠正许多与自闭症相关的生化和分子异常,包括氧化应激和抗氧化能力下降,谷胱甘肽合成缺陷,线粒体功能障碍和低氧化磷酸化,脂质过氧化增加和神经炎症(11-16)。虽然尚不清楚这些异常是病因还是继发表现,但纠正它们往往会改善ASD行为(17)。
                其次,包括萝卜硫素在内的多种小分子可以通过激活“应激蛋白组”来改善许多不相关的遗传疾病,而“应激蛋白组”调控着上述许多破坏过程。萝卜硫素、羟基脲、苯基丁酸酯和曲古抑菌素A在体外已被证明具有治疗潜力,可在许多不相关的遗传疾病中重建细胞内稳态(18)。
                第三,萝卜硫素是一种膳食植物化学物质,由其前身硫代葡萄糖酸盐衍生而来,在十字花科植物中含量丰富,并根据其预期用途有资格作为一种食品、膳食补充剂或药物。因此,有理由认为萝卜硫素具有低毒性,并且对人类对其具有良好的耐受性(10,19,20)。
                第四,广泛流传的轶事报道表明,发烧可以显著但暂时改善许多自闭症患者的紊乱行为(21)。值得注意的是,改善的程度(主要是刻板的行为和不恰当的言语)与发烧或自闭症的严重程度无关(21)。该研究明确表明,阐明发热反应可能有助于深入了解ASD的机制,并为新的治疗方法指明方向(21,22)。发热上调热休克蛋白和中枢神经系统多个细胞过程的相关机制,包括突触传递(23,24),并可能改善ASD抑制的远程大脑皮质连接(25)。萝卜硫素也上调了热休克反应的表达(26)。
                我们假设,每天在饮食中使用一定水平萝卜硫素的治疗可能会降低ASD患者社交障碍行为的严重程度。在干预前、干预中、干预后三个阶段,用三个被广泛验证的行为结果量表评估行为变化(图1)。父母/护理人员完成异常行为检查表(ABC)(27)和社会反应量表(SRS)(28)。研究医生完成临床总体印象严重程度(CGI-S)和临床总体印象改善 (CGI-I) 量表(29,30)。
                结果
                受试者特征。在40名接受安慰剂或萝卜硫素治疗并第一次返回(第4周)的受试者身上,90%以上的预定评估已经完成。22名受试者(安慰剂6名,萝卜硫素16名)在第22周(即治疗结束后第4周)也进行了评估(表1和图S1)。四名受试者(安慰剂组1名,萝卜硫素组3名)在接受首次治疗前失访。
                所有受试者均为男性,在登记时年龄为13-27岁(中位数:17岁)。绝大多数受试者(40人中有32人; 80%)有发热行为改善史。萝卜硫素组和安慰剂组的受试者匹配良好,在不同的人口统计学、行为和临床特征、行为结果评分、体格检查异常、血液化学、血清学和尿液分析方面,基线没有差异(表S1)。
                结果分析。26名萝卜硫素治疗组和14名安慰剂组受试者的ABC和SRS总行为评分从登记到治疗结束18周,再到4周恢复期后的变化情况见图2-4,表1和表2。治疗组在4周、10周和18周时ABC评分差异显著(图2 B和E分别为ABC和SRS)。在第18周,ABC评分降低了34%,SRS评分降低了17%,这些在停止治疗后趋于无显著差异(图2 B和E以及表1和表2)。
                在4周、10周和18周随机分配到萝卜硫素的受试者对于ABC的烦躁、嗜睡、刻板症和多动症分量表以及SRS的意识、交流、动机和习惯分量表改善显著(参见图3和 表1和2)。在停止萝卜硫素治疗后,ABC和SRS评分均趋向于回归基线。
                在18周(表1和表2) CGI-I量表的子量表分析中,萝卜硫素受试者中分别有46%(12/26)、54%(14/26)和42%(11/26)在社交互动、异常行为和语言沟通能力方面有很大或非常大的改善,而安慰剂组改善情况分别为0%( 0 / 11;P = 0.007)、9% (1 / 11;P = 0.014)以及0% (0 /11; P = 0.015)。
                ABC和SRS总分从基线水平到18周的个体变化如图4所示。阳性反应被定义为自基线以来总ABC和SRS评分下降30%。服用萝卜硫素的受试者中,SRS评分有阳性反应的占35%(9/26),而服用安慰剂的受试者中,这一比例为0%(0/11)( Fisher’s exact test P = 0.036);服用萝卜硫素的受试者中,ABC评分反应阳性的占60%(15/25),而服用安慰剂的受试者中,这一比例为20%(2/10)(P = 0.059)。
                在研究过程中,我们的临床印象是,40名受试者中有13名在社交和行为方面有明显改善,通常在干预4周后就能观察到;所有人都属于萝卜硫素干预组。 在对家庭和看护人员的询问过程中,在揭盲之前,26人中有17人反映他们的儿子服用了萝卜硫素,他们报告说在治疗的第一个月内病情逐渐好转,并正确地判断出他们的小组分配情况,而其余的9名服用萝卜硫素的儿童——以及14名服用安慰剂的儿童中除1名以外的所有人——病情没有好转,他们认为自己的儿子没有服用萝卜硫素。家长和护理人员自发地报告了对萝卜硫素的阳性反应,他们评论(在披露治疗分组之前)服用这种活性化合物的ASD患者在社会反应性、行为依从性和平静性方面有改善。
                安全和不良事件。萝卜硫素治疗有效改善了ASD的核心异常行为,且安全、耐受性好(表S2)。值得注意的是,在任何时间点上,没有一个实验室结果超出正常范围(数据集S1)。令人意外的是,与安慰剂组相比,萝卜硫素组在18周期间体重明显增加(4.31磅vs 0.31磅,P = 0.056)。无论是在基线还是在研究期间,萝卜硫素组的脉率都较低。试验期间记录了36例不良事件。在服用萝卜硫素的受试者中,有12-19%的人出现呕吐、攻击性增强、腹痛、胀气加重、易怒、便秘、腹泻、发烧、头痛和季节性过敏加重;安慰剂组的发生率相同(P > 0.10)。两名受试者有一次无缘无故的癫痫发作:一名在服用萝卜硫素3周后,最近有癫痫发作史,但没有披露;另一名出现在停止治疗3周后,既往有癫痫发作史(1年以上),抗癫痫药物控制良好。虽然自闭症患者有癫痫发作的倾向(31,32),但我们不能排除癫痫发作可能是萝卜硫素在ASD中的不良事件。
                讨论  所有在揭盲之前的行为结果评估(ABC,SRS,CGI-I)以及研究医生和许多父母/看护人员的临床观察,表明许多受试者在本研究中使用萝卜硫素治疗期间有统计学上显著和临床意义的改善。个体ASD患者的显著改善表明,进一步研究萝卜硫素在ASD中的应用具有广阔前景。
                虽然我们观察到萝卜硫素治疗的大部分ASD患者的行为都有持续的、显著的改善,但这是一项单点、有限剂量范围的研究,研究对象只有44名男性,主要是白种人,年龄在13-27岁之间,其中4人在第一次随访前退出了研究。虽然我们在基线时并没有专门针对适应性或认知技能进行测试,但我们的队列包括患有中度和重度ASD的受试者,这些受试者的总基线SRS和ABC评分存在显著差异(图4和表1和表2)。由于ASD的病因、发病机制和症状有相当大的异质性,我们的研究结果需要得到证实。
                尽管如此,这项研究至少可以阐明ASD的一部分基本病理生理学。大多数临床研究和药物的目的是抑制ASD的棘手症状。相比之下,据我们所知,这项研究是为数不多的几个旨在通过使用萝卜硫素来针对ASD的核心临床特征和基本的生化异常(氧化应激和抗氧化能力不足,增加对亲电毒性和炎症的敏感性)的研究之一。
                我们的建议是,在发热期间行为改善的ASD患者也会对萝卜硫素产生反应,但这一建议未能得到证实,因为与大多数ASD患者(35%)相比,我们的队列中出现了异常高的发热反应者(80%)(33)。与ASD患者发热时行为的迅速变化不同,本研究中对萝卜硫素的反应出现在数周内。这一发现表明,萝卜硫素可能导致多个表现不佳的细胞信号通路的基因转录增加(34,35)。萝卜硫素可能只是能够改善导致整个生物体功能异常缺陷的几种小分子之一。进一步研究萝卜硫素在细胞水平上的作用,如果得到证实,将有助于发现在ASD中具有类似潜在作用机制的新药。
                细胞应激反应的激活,除了它的治疗潜力,是已知的保护细胞免受环境毒素。最近,我们证明了萝卜硫素作为一种环境解毒剂的有效性(36)。此外,萝卜硫素能够激活Keap1-Nrf2细胞保护信号通路(10),因此,萝卜硫素可能同时保护ASD患者免受影响大脑发育的环境和内源性危险因素的影响(37)。鉴于其良好的安全性,未来的研究应着眼于萝卜硫素在产前预防ASD以及早期治疗儿童ASD方面的潜在益处。
                材料与方法研究方案。本研究是在马萨诸塞州总医院(MGH)的Lurie自闭症中心(MGH)进行的,获得了MGH和约翰霍普金斯大学机构审查委员会的批准,并在ClinicalTrials.gov (NCT 01474993 under Food and Drug Administration IND 113542)注册。所有有能力的受试者、家长或护理人员均给予书面知情同意。所有受试者均符合自闭症的诊断标准(1)。从2011年2月至2013年7月共纳入44例男性ASD患者。自闭症诊断观察表(43人),由一名训练有素的心理学家/测试人员操作或由一名训练有素的医生(2名受试者)操作DSM-4(人)症状清单,在筛查来访时用于确认自闭症的诊断。所有受试者在CGI-S测试中都是中度至重度自闭症患者,具有不同的认知能力(表S1)。
                选择标准为男性,年龄13-30岁,无并发慢性疾病,1年内无活动性癫痫病史,肝肾、甲状腺功能正常。如果有的话,在研究期间,受试者继续他们的常规药物治疗。
                MGH研究药房将受试者分成三组,根据电脑随机排列的区块,分配安慰剂或萝卜硫素。根据父母报告的发热疾病期间行为改善史,萝卜硫素和安慰剂治疗按2:1的比例分配。医生和研究人员不知道分组情况。选择44名受试者提供至少80%的能力来测试SRS的主要假设,使用α= 0.05的双尾双样本t检验并假设SRS的平均变化的真实差异为15个单位,SD为16个单位。这大约是男性儿童和青少年ASD患者1年以上观察到的自然变化平均幅度的两倍(38)。
                该研究包括7次访问:筛选,随机化,开始治疗,第一次给药后的24小时、4、10和18周。治疗在18周后停止,受试者在22周返回。进行病史、体格检查(包括生命体征、不良事件报告、SRS、ABC和CGI-I评估)(图1)。在第4、18和22周的访视中,还进行了血液学、化学和尿液分析。
                在最终受试者完成随访后,我们联系了所有家庭,询问他们对研究的印象以及他们的孩子在治疗期间的进展。然后,他的家人被告知他是否服用了萝卜硫素或安慰剂。
                药物管理和协议时间表。将富含萝卜硫素的西兰花芽苗提取物胶囊保存在- 20℃,并定期进行微生物学和萝卜硫素效价(SI材料和方法)检查(8)。难以分辨的安慰剂胶囊含有微晶纤维素。每日服用萝卜硫素或安慰剂,连续18周。受试者根据体重给药: 体重<100磅给予50μmol萝卜硫素(1粒胶囊),体重101-199磅给予100μmol萝卜硫素(2粒胶囊),体重>200磅给予150μmol萝卜硫素(3粒胶囊)。服用安慰剂的受试者根据他们的体重服用相同数量的胶囊。MGH研究药房将胶囊装在密封的瓶子里分发给参与者,并指示他们将胶囊放在家用冰箱中。
                行为结果的评估。ABC是由父母或护理人员评估的包含58项的问卷,旨在评估药物效果;每一项都按严重程度从0到3进行评分(27)。ABC还评估了几个子症状(易怒、嗜睡、刻板印象和多动症)。SRS是一份由父母或护理人员评估的65分社会沟通问卷,涵盖五个子量表(意识、认知、沟通、动机和自闭症行为)(28)。每个SRS项目都按1-4分进行评分;总评分是我们的主要疗效终点。
                俄亥俄州自闭症临床总体印象严重程度量表(CGI-S,也被指定为OACIS-S,仅在筛查时评估)(29,30)是一个临床分级的自闭症行为严重程度评估(按严重程度从1级增加到7级),包括以下子领域:总体自闭症严重程度、社会互动、异常行为、重复或仪式性行为、语言和非语言沟通、多动症/注意力不集中、焦虑、感官敏感和有限/狭隘的兴趣。俄亥俄州自闭症临床总体印象改善量表(CGI-I或OACIS-I)(29,30)是一项临床评定,评估患者在干预期间的行为变化程度。
                统计分析。44名受试者最初被纳入并随机分配到萝卜硫素治疗组(n = 29)或安慰剂组(n = 15);4名受试者在第一次(4周)回访前停止参与研究。其余40名受试者的行为评分,完成了至少部分结果测量评估(14安慰剂和26萝卜硫素),在我们的主要结果中进行了描述,如图2 - 4和表1和表2所示。为了补偿正常波动导致的ABC/SRS评分的偶然变化,我们在筛选和随机访问中都获得了这些评分,并使用它们的平均值与随后的ABC/SRS评分进行比较。我们的初步分析使用了4、10、18和22周个体的平均预处理值的评分差异。我们假设的检验是萝卜硫素治疗组与安慰剂治疗组在基线至18周ABC和SRS评分变化上的差异,以及在22周时回归基线的差异。
                每个结果都采用共享基线混合效应一般线性模型进行建模,该模型具有固定的访视效果,且在访视和治疗组与随机受试者特定截距和斜率之间存在交互作用,且具有非结构化协方差。缺乏主要的治疗效果(即,“共享基线”)恰当地反映了随机化前抽样的人群的真实状态,并且具有调整基线上任何机会差异的优势,其方式类似于ANCOVA(39)。在每次随访中,使用最小二乘平均的线性对比来估计治疗组和对照组之间的基线变化。在其假设下,混合模型得到的估计值是无偏的,只要有后续的损失,并且缺失的测试分数可以通过模型假设下的观察分数预测。一项包含所有44名受试者的意向治疗分析得出了类似的结论(SI材料和方法)。
                采用SAS v. 9.3软件(SAS Institute)和Stata v.11.2软件(Statacorp)进行统计分析。

                图1:研究萝卜硫素对ASD影响的时间进度表

                表1:萝卜硫素治疗对异常行为检查表(ABC)和社会反应性量表(SRS)评分的影响

                图2:总ABC和SRS分数的变化。40名男性ASD受试者每天用安慰剂(最初n = 14)或萝卜硫素(最初n = 26)治疗4周、10周和18周,接着是4周未治疗期(22周)。图A(ABC)和D(SRS)显示所有观察结果。B表示ABC、E表示SRS在4、10、18和22周的原始未调整总分(±SEM)的变化。在萝卜硫素处理后,在4、10、18周ABC评分的降低分别为-20.2%(P = 0.035)、-31.5%(P = 0.002)和-33.6%(P <0.001)。SRS的相应变化为-12.2%(P = 0.29),-12.2%(P = 0.080)和-16.8%(P = 0.017)。C(ABC)和F(SRS)显示安慰剂和萝卜硫素治疗受试者在所有时间点的总分变化。 所有变化均从每个受试者在时间0的初始值计算得来(在筛选和登记时获得的两个值的平均值)。
                 

                Table 2. 对于可获得分数的37名受试者,在18州的临床总体印象改善(CGI-I)得分

                图3:ABC评分在易怒、嗜睡、刻板印象和多动症方面的变化。用萝卜硫素或安慰剂治疗4周、10周和18周后,以及未经治疗的4周恢复期(22周)。显示了萝卜硫素和安慰剂治疗受试者的原始,未调整的平均变化值(±SEM)。在治疗10周和18周时,对于烦躁和嗜睡的95%置信水平(*)的变化是显著的。
                 

                 
                图4:在基线和18周后,接受安慰剂和萝卜硫素治疗的受试者的ABC和SRS的总分。18周时,ABC总分为35分(10个安慰剂组和25个萝卜硫素组),SRS总分为37分(11个安慰剂组和26个萝卜硫素组)。在18周只有萝卜硫素治疗的差异是显著的,在ABC量表得分从62.4到45.0 (a) (P < 0.001),SRS得分变化从121.5到105.2 (B) (P < 0.001)。所示受试者在第1周和第18周接受安慰剂治疗时,ABC评分为62.4和62.6,SRS评分为121.5和117.5。
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